本发明公开了一种高效催化制备假尿苷的全细胞催化剂及其制备方法和应用,所述全细胞催化剂为表达yeiN或yeiN‑102突变体的大肠杆菌基因工程菌,所述yeiN的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,所述yeiN‑102突变体是在yeiN第102位氨基酸残基发生了替代;基于所述全细胞催化剂,本发明开发了全细胞法制备假尿苷的方法,在本发明方法中,可通过提高菌体浓度直接获取假尿苷,无需单独的去磷酸化处理,而且通过反应条件优化,将假尿苷的合成效率提高到了92.96%,本发明对假尿苷的绿色合成具有重要意义。