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本发明提供了一种基于RNA干扰动态调控酿酒酵母中质粒拷贝数的方法。该方法通过重建一个正交RNAi系统，将酿酒酵母作为一个具有动态可编程质粒拷贝数的合成生物学底盘，并通过整合来自卡斯特利酿酒酵母的异源RNAi机制，设计靶向质粒编码选择标记的序列特异性siRNA，建立了一个化学诱导的基因剂量控制平台，实现质粒拷贝数的动态调控，从而优化基因表达剂量，提高生物合成效率。将RNAi介导的拷贝数调节应用于类胡萝卜素生物合成途径，与静态质粒系统相比，番茄红素滴度增加了18.6倍。该方法进一步丰富了合成代谢调控的工具集，在提升微生物细胞工厂生产性能方面的巨大潜力，为合成生物学领域内的代谢工程优化提供了新思路。

本发明公开了一种酿酒酵母从头合成柚皮素工程菌株及其构建方法与应用，上述工程菌按如下方法对酿酒酵母S.cerevisiae CEN.PK2‑1C基因组进行改造构建：敲除底物竞争途径基因和过表达抗反馈抑制基因等提高前体物质酪氨酸的代谢通量j异源表达酪氨酸解氨酶、4‑香豆酰：CoA‑连接酶、查尔酮合酶和查尔酮异构酶实现柚皮素的从头合成。最后，通过多拷贝位点高效表达Sc4CL和HaCHS进一步提升了柚皮素的产量。

本发明涉及一种蓝光诱导酿酒酵母定点DSB系统，构建步骤如下:构建site‑I‑SceI‑KanM转化盒，利用pC120‑El222蓝光诱导型启动子,利用PEG/LiAC法向酵母中进行转化，即得蓝光诱导酿酒酵母定点DSB系统。本发明以酿酒酵母为载体，利用蓝光介导调节归位内切酶I‑SceI表达，并建立的定点DSB诱导系统,并验证了系统的可行性。本发明的提供的蓝光诱导酿酒酵母定点DSB系统，在蓝光诱导下，无毒无害、相应迅速，操作简单，可逆性好。

本发明属于生物饲料领域，涉及一种协同降解发酵玉米秸秆转化成高品质生物饲料原料的方法；首先将来源于Irpex lacteus的锰过氧化物酶基因序列进行偏爱性优化，以优化的基因为模板进行PCR扩增，与pREP连接后转化到大肠杆菌感受态细胞中，获得重组穿梭质粒并导入缺陷型粟酒裂殖酵母感受态细胞中，得到重组锰过氧化物酶酵母工程菌；然后与粗糙脉胞菌、重组S.pombe‑man和产阮假丝酵母混合，添加氮源、氯化钙、硫酸锰、漆酶、葡萄糖氧化酶和小分子物质激活剂进行菌酶协同混菌发酵玉米秸秆；本发明合理利用农业废弃物，能够有效促进秸秆中木质纤维素的转化，在短时间内显著提高发酵饲料的品质，获得高品质生物饲料。

本申请提供了一种高效，快速，简易地克隆目的基因片段的方法，尤其是克隆和编辑长度大于100kb，优选大于300kb的DNA大片段的方法。所述方法包括目的基因片段的获得、克隆、扩增、酶切和转化等过程。

本发明属于生物工程技术领域，公开了一种微生物生产的天然活性产物的高效分离方法，针对传统分离工艺中路线复杂、收率低、高生产成本等问题，本发明基于天然活性产物的外排和内运系统，提出建立天然活性产物的“合成‑外排‑摄取”系统，是一种适用于微生物中完全或部分分布于胞内的微量天然活性产物的高效分离系统，先后通过构建天然活性产物的“合成‑外排”细胞，构建产物C的“摄取”细胞，菌株A液体发酵生产产物C，菌株A发酵液的收集，菌株B高密度培养及产物C的富集，产物C的分离纯化完成分离，不仅能够实现天然活性产物与微生物培养液中残留组分的高效分离，还能实现天然活性产物与其结构类似物的高效分离。