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mEOS纳米抗体及其制备方法和应用，涉及生物工程技术领域，本发明通过构建mcherry或mEOS纳米抗体文库，筛选出了特异的阳性单克隆纳米抗体，并检测出了能够与mcherry蛋白结合的两种mcherry纳米抗体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3所示，以及能够与mEOS蛋白结合的七种mEOS纳米抗体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17所示。本发明构建的mcherry或mEOS纳米抗体，相对传统抗体而言可提高产量、降低成本，并获得更好的稳定性。