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一种新金色分枝杆菌工程菌的基因编辑方法及系统，属于基因工程技术领域。本发明公开的编辑系统包括pMV261‑rAPOBEC/n(d)Cas9/UGI质粒和pTarget‑sgRNA质粒，pMV261‑rAPOBEC/n(d)Cas9/UGI质粒可以融合表达丧失切割活性的Cas9蛋白、胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶糖苷酶抑制剂，在sgRNA的引导下可在靶向目的基因，对序列N20片段中的胞嘧啶(C)进行脱氨反应，转变为尿嘧啶(U)，并在后续复制过程中变为胸腺嘧啶(T)形成TAG，TGA和TAA终止密码子，达到沉默或中断目的基因正常反应的目的。该系统对宿主的毒性低，可特异性编辑，且稳定传代，编辑效率最高可以达到50％。

本发明公开了一种CRISPR/Cas9介导的附加内源RBS的微生物次级代谢产物强化启动系统，属于基因工程技术领域。本发明基于CRISPR/Cas9基因打靶系统实现了内源核糖体结合位点和外源启动子的联合，构建了附加lRBS的微生物次级代谢产物强化启动系统；同时联合孢子种间结合转移，提高了阳性突变株得率，从而显著提高了微生物次级代谢产物的产量。

本发明公开了一种适用于沙雷氏菌基因改造的CRISPR‑Cas9双载体系统，包括：载体pCAS‑p15A‑sacBΔλ‑Red和载体pTarget F‑Gm。本发明弥补沙雷氏菌基因编辑系统方面的局限性，为沙雷氏菌基因功能的验证和沙雷氏菌株次级代谢产物产生机制的研究提供了平台。利用本发明构建的CRISPR‑Cas9双载体系统进行基因luxS的敲除与回补实验，对沙雷氏菌YD25次级代谢产物灵菌红素和Serrawettin W2的共调控机制进行了初步研究。确定了基因luxS对灵菌红素和Serrawettin W2合成的正调控作用。

本发明公开了一种利用同工酶共催化合成2,3‑丁二醇的方法，通过两个以上具有互补性催化优势的2,3‑丁二醇脱氢蛋白(又称2,3‑丁二醇脱氢酶)的共同催化，能够将2,3‑丁二醇的前体高效并且彻底地转化为2,3‑丁二醇。本发明通过同工酶共催化合成2,3‑丁二醇的方法，不仅能够提高2,3‑丁二醇合成的效率，还能够实现其前体物质完全转化，因而能够显著提高细胞代谢网络中2,3‑丁二醇合成支路的通量以及2,3‑丁二醇合成过程的经济性。

本发明公开了一种提高梭菌中蛋白表达效率的方法，将目标蛋白与核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的非经典分泌蛋白融合，在丙酮丁醇梭菌CGMCC No.5234中进行蛋白表达。与现有技术相比，本发明提供了一种全新的方法提高重组蛋白在梭菌中的蛋白表达效率，为优化梭菌中重组蛋白的制备与应用奠定了技术基础。

本发明涉及一种sll0659基因在合成集胞藻类胡萝卜素中的应用。该应用所涉及的sll0659基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供了一种在集胞藻PCC6803β‑胡萝卜素合成中具有重要作用的集胞藻PCC6803中sll0659基因的应用，通过将集胞藻PCC6803中的sll0659基因敲除后，集胞藻PCC6803的叶黄素含量增加了22.3％，玉米黄素含量增加了31.3％，而海胆酮含量降低了34.3％，β‑胡萝卜素百分含量则降低了1.3％。同时，HPLC检测结果表明，与野生型集胞藻PCC6803相比，sll0659基因敲除突变体中类胡萝卜素组分中有一个明显的峰，经与标品对照检测，确定其为α‑胡萝卜素。

本发明公开了一种提高乳酸片球菌的电转化效率的方法，在murG起始codon前插入4‑8个碱基序列，把RBS和murG基因起始codon之间的碱基加长来弱化细胞壁合成的murG基因的表达，造成其细胞壁的不完善，提高乳酸片球菌的电转化效率。制备原始乳酸片球菌和双交换后的乳酸片球菌感受态细胞，将pMG36e质粒电转入感受态细胞，比对结果显示在RBS和murG基因起始codon(AUG)之间增长碱基序列显著提高了电转化效率100～2000倍。此方法只需把菌改造一次，之后因为电转化效率的大幅提高，基因操作简单，阳性率高，特别是可用于高通量筛选用。