本发明涉及分子生物技术领域,尤其涉及一种多鱗鯔鰕虎魚线粒体基因组全序列引物及设计、系统进化分析全序列扩增方法,包括如SEQ ID NO.1~24所示的十二对引物。本发明解决了目前没有能够对多鱗鯔鰕虎魚进行线粒体基因组全序列扩增的问题,具有(1)一次性扩增出其线粒体基因组,通过测序拼接能够快速获得其基因组全序列,便捷高效的优点;(2)提供一种多鱗鯔鰕虎魚线粒体基因组全序列引物,省时省力,且节约试剂成本;(3)提供的多鱗鯔鰕虎魚线粒体基因组全序列引物的系统分析方法为多鱗鯔鰕虎魚群体遗传、种质资源保护和可持续开发利用以及鰕虎魚类的系统发育研究提供了重要的分子手段及数据积累等优点。