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本申请提供一种外切酶III驱动的三维DNA纳米机器及其应用，所述三维DNA纳米机器，包括信号探针@纳米金结构和检测探针，信号探针中包含信号探针序列和荧光分子，检测探针中包含半胱天冬酶的识别位点和DNA触发链，DNA触发链与信号探针序列互补；检测探针在半胱天冬酶存在下裂解释放出包含DNA触发链的结构，该结构中的DNA触发链与信号探针杂交形成双链DNA，双链DNA可被外切酶III识别并消化，释放出信号探针中的荧光分子，DNA触发链随即恢复单链并继续与其他信号探针杂交，从而实现荧光分子的循环释放。本发明可实现对多种半胱天冬酶活性的的同时检测，且检测灵敏度高，而且还可用于对半胱天冬酶抑制剂的筛选。