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本发明公开了一种酪氨酸磷酸酶生物传感器及其检测方法与应用，包括磁珠、肽‑DNA偶联物、DNA模板、信号探针；肽‑DNA偶联物中，肽链一端连接第一DNA序列的5'端，肽链含有磷酸化的酪氨酸；肽链另一端用于连接磁珠；所述DNA模板从5'端至3'端由两个第二DNA序列和一个第三DNA序列组成，第三DNA序列与第一DNA序列能够互补，DNA模板与第一DNA序列杂交再聚合后能够形成具有两个切口酶识别位点的双链DNA，第二DNA序列的互补链为脱氧核酶；信号探针为核苷酸序列，核苷酸序列的两端分别连接荧光团和猝灭剂，核苷酸序列能够与脱氧核酶互补；脱氧核酶为在二价阳离子依赖性反应中裂解互补的RNA序列。