本发明公开了一种脂肪酶突变体及其在制备(S)‑2‑氯苯甘氨酸甲酯中的应用,该脂肪酶突变体由SEQ ID No.2所示氨基酸序列第157位的谷氨酰胺突变为苯丙氨酸,第189位的异亮氨酸突变为赖氨酸,且第154位的缬氨酸突变为天冬氨酸而获得。本发明通过分子对接和定点饱和突变,筛选获得了可明显缩短不对称水解反应时间且对R型2‑氯苯甘氨酸甲酯方拆分效率高、选择性高的脂肪酶突变体,该突变体在反应12h后(S)‑2‑氯苯甘氨酸甲酯的得率达到了72.81%,ee值为95.24%,相对于野生型来说,实现了活性的提高和选择性的反转,同时缩短了反应时间。