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本发明公开了一种普鲁兰酶突变体、工程菌及其应用，所述普鲁兰酶突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第365位、第401位、第504位或第499位氨基酸进行单突变或多突变获得的。本发明构建的普鲁兰酶突变体的催化活性、热稳定性与耐酸稳定性均得到了提高，其中突变体PulAR‑A365V‑401C‑H499A‑T504V的催化效率较野生型普鲁兰酶PulAR在pH5.0、6.0，60℃条件下分别提高了6.6倍与9.6倍；在60℃，65℃的半衰期分别比野生型普鲁兰酶提高了2.6和3.1倍，且在pH 4.5与pH 5.0的半衰期分别比野生型普鲁兰酶提高了1.6和1.8倍。

一种提高胞内普鲁兰酶提取效率的方法，属于微生物和酶工程技术领域。本发明采用两种特殊试剂对巴斯德毕赤酵母突变株处理，首先将重组巴斯德毕赤酵母突变体GS115/pPICK‑BdP5 WB138与10×试剂D反应，随后在冰水中放置，再加入10×试剂E反应。离心收集细胞后用柠檬酸缓冲液悬浮细胞进行超声波破碎。经过两种试剂处理的细胞经超声波处理6 min就将细胞全部破碎，破碎液中酶活保留在85%以上。使用本发明所提供的方法及专用处理液可以大幅度减少细胞破碎所需要消耗的电力等成本，减少设备占用时间。

一种提高普鲁兰酶终浓度的发酵液处理方法，属于酶工程和发酵工程技术领域。本发明将处理溶液C与普鲁兰酶发酵上清液混合后保温，超滤浓缩，即得高酶活的普鲁兰酶发酵液。采用本发明方法，在以重组菌解淀粉芽孢杆菌BF7658/pUC980-BdP发酵制备普鲁兰酶的后提取阶段，可以改善普鲁兰酶发酵液的超滤性能。经本发明处理的发酵液上清液经超滤浓缩后得到的浓缩液的酶活是未经溶液C处理的发酵液经同样超滤浓缩后得到的浓缩液的酶活的1.75倍以上。

本发明提供一种定点突变改造的碱性普鲁兰酶及其应用，本发明定点突变改造的碱性普鲁兰酶是在SEQ ID NO.2所示的氨基酸基础上，将第744位苯丙氨酸突变为丙氨酸。对突变体F744A转化大肠杆菌进行异源表达，发现突变体酶活提高了32.18%；热稳定性也得到了提高，T5030为55.84℃，比原始酶PulSL3△C提高了2.94℃；突变体F744A的pH稳定范围更宽，在pH 5.0~10.0范围内保温1 h仍可保留90%以上的酶活力。作为添加剂应用于洗涤剂行业，可以明显提高洗涤效果。