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本发明公开了一种利用化学‑酶法生产L‑草铵膦的方法，所述方法为：以外消旋N‑乙酰草铵膦为底物，以含羧肽酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎后提取的纯酶为催化剂，以pH值为5～10的缓冲液为反应介质，在45℃水浴摇床200rpm条件下反应，反应完全后，获得含D‑N‑乙酰草铵膦和L‑草铵膦的反应液，将反应液分离纯化，收集D‑N‑乙酰草铵膦消旋化后用于循环拆分，同时获得L‑草铵膦。本发明方法不需要辅酶循环系统及与产物结构相似的氨基供体，反应步骤简单，易于分离，光学选择性高(ee值99％)，离子交换柱分离效果明显，更易得到高纯度的L‑草铵膦(纯度为98％)。