本发明公开了一种对硝基苄基酯酶突变体及编码基因，以及含对硝基苄基酯酶突变体的基因工程菌，及其在酶催化dl‑薄荷酯的手性拆分制备l‑薄荷醇中的应用。所述对硝基苄基酯酶突变体由氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的对硝基苄基酯酶第109位、110位、193位、270位、273位、314位或362位的氨基酸残基进行组合突变获得。本发明的有益效果主要体现在：①本发明酯酶突变体无需添加助溶剂，酶催化活性维持较高水平；②在无助溶剂体系下，突变体酶催化的立体选择性较野生型显著提高。这些突变体酶通过大肠杆菌过量表达后用于催化反应，并以20～200g/L的dl‑乙酸薄荷酯为底物，进行水解拆分制备l‑薄荷醇，结果表明产物l‑薄荷醇的eep值>99％，底物转化率>95％，表现出良好的工业应用性能。
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