本发明公开了重组草铵膦脱氢酶、基因工程菌及其在制备L‑草铵膦中的应用,该重组草铵膦脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过交错延伸pcr基因重排技术,构建获得重组草铵膦脱氢酶的基因文库,并从中筛选获得酶活、催化性能和立体选择性均高的重组草铵膦脱氢酶;该重组草铵膦脱氢酶的活性较之前突变体PPTDHE3‑A164G和突变体PPTDHE0‑V375S分别提高了31%和35%,最终完全催化108g/L的2‑羰基‑4‑(羟基甲基氧膦基)‑丁酸生产L‑草铵膦仅仅需要20分钟(转氨酶通常需要40小时),且ee值大于99.5%。