本发明属于合成生物领域,具体涉及细胞色素P450酶突变体及其在制备甲维盐中间体中的应用,所述细胞色素P450氧化酶突变体由如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第119位、第124位进行单点或多点突变得到。本发明通过对来自Streptomycestubercidicus的细胞色素P450氧化酶的关键点进行理性改造,筛选获得的突变体的转化率得到进一步提高。使用本发明提供的细胞色素P450氧化酶突变体,可以以阿维菌素为底物,在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖以及辅因子存在的条件下,直接制备C4"羰基‑C5"羟基‑阿维菌素,该方法反应条件温和、催化剂成本低廉,是制备C4"羰基‑C5"羟基‑阿维菌素的理想方案。