本发明公开了一种D‑氨基酸氧化酶突变体、工程菌及应用,属于生物技术领域。D‑氨基酸氧化酶基因来源于胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa),其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。所述突变体是在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列第54位、第58位、第213位、第223位、第225位发生单突变或多位点突变获得的。本发明构建的D‑氨基酸氧化酶变体工程菌株,配合稳定剂的使用,有效提高了草酰乙酸的稳定性和得率,产物浓度最高可达34.7g/L,转化率最大可达87.4%。