本发明公开了一种用于鉴定安吉小鲵(Hynobius amjiensis)的多重PCR引物和方法及应用,其中,所述多重PCR引物包括如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的引物对1,以及如SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的引物对2。通过上述方案,从安吉小鲵成体、蝌蚪或是卵带等组织中提取其DNA,利用本发明提供的两对PCR引物对,根据琼脂糖凝胶电泳检测中是否出现两条条带来对安吉小鲵进行特异性鉴定,避免了常规DNA测序及序列比对等繁琐步骤,实现了仅需通过一次PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测即可鉴定安吉小鲵,检测时间短,操作简便且实际使用时更为经济而高效的效果。