本发明公开了大肠杆菌‑芽孢杆菌穿梭质粒载体及其构建方法和应用,该穿梭质粒载体包括pTC、pBE、pTN和pTK中的任意一种,序列分别如SEQ ID NO.1‑4所示。本发明从PUC19出发获得大肠杆菌复制起点和氨苄青霉素抗性的基因片段,从pMarA出发获得芽孢杆菌温敏复制起点和卡那霉素抗性和红霉素抗性的基因片段,从pBEST502和pSG1164中分别获得新霉素抗性基因和氯霉素抗性基因,经过酶切和酶链接构建了大肠杆菌芽孢杆菌穿梭质粒载体。本发明中的四个质粒载体可在不同芽孢杆菌中穿梭、共存以及消除,避免质粒发生漂移对环境产生污染,可潜在应用于外源蛋白的表达,实现对芽孢杆菌基因组DNA的编辑。