本发明公开了一种米曲霉脂肪酶突变体及在拆分(R,S)‑2‑(4‑羟基苯氧基)丙酸酯制备(R)‑2‑(4‑羟基苯氧基)丙酸酯中的应用,所述突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第38位或第230位进行定点饱和单突变或多突变获得的。本发明通过比较突变体酶AOL‑3F38N、AOL‑3F38N‑V230R和未突变酶AOL‑3的水解能力,结果发现突变体酶AOL‑3F38N、AOL‑3F38N‑V230R的水解活性是未突变脂肪酶的3.4倍和4.0倍,改造后的脂肪酶的热稳定性在50℃以后表现的更好,(R)‑2‑(4‑羟基苯氧基)丙酸酯产率提高,更加适合工业化生产。