本发明公开了一种来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体、编码基因及其在水解外消旋2‑羧乙基‑3‑氰基‑5‑甲基己酸乙酯合成(3S)‑2‑羧乙基‑3‑氰基‑5‑甲基己酸中的应用,所述突变体是将SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第206位、207位和259位氨基酸中的一位或多位进行突变后获得。经过蛋白质分子改造,TTL立体选择性水解CNDE的活力由4.50U/mg提高到160.55U/mg,远高于目前已报道的脂肪酶水解CNDE的活力。因此,本发明所获得的突变体在高效催化CNDE合成普瑞巴林手性中间体(3S)‑2‑羧乙基‑3‑氰基‑5‑甲基己酸中具有良好的应用前景。