本发明公开了重组酮酸还原酶突变体、基因、工程菌及其应用,所述重组酮酸还原酶突变体是将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列第127位、第244位、第245位或第250位进行单位点或多位点突变获得的,所述突变包括定点饱和突变、组合突变或者迭代饱和突变。以2-氧代-4-苯基丁酸为模式底物时,底物装载量由提升至250mM,ee值均大于99%。最终应用于2-氧代-4-苯基丁酸不对称还原制备光学纯(R)-2-羟基-4-苯基丁酸。该反应具有成本低、绿色环保、工艺简单、催化效率高、无需添加外源性辅酶等优势,工业化前景广阔。