本发明提供一种检测叶酸代谢通路相关基因的试剂盒,包括用于检测与叶酸代谢通路相关的MTR基因RS1805087位点、CBS基因RS5742905位点、MTRR基因RS1801394位点、MTHFR基因rs1801131位点和MTHFR基因RS1801133位点的引物组合物,所述引物组合物的序列包括5对PCR引物和5个紧邻SNP位点的正向延伸引组合物,如SEQ ID No:1-15所示。该试剂盒不仅可以实现一次性的多基因位点检测,而且降低了最低检测限至1ng/ul,检出率高,实现大通量快速地进行基因位点的分型,保证样本检测的准确性100%。