本发明属于水产养殖中性别鉴定技术领域,公开了一种用于乌苏里拟鲿性别检测的多重PCR引物及检测方法,提供了3个乌苏里拟鲿雄性特异位点,其核苷酸序列为SEQ ID NO:1‑3;本发明还提供从上述性别特异位点设计的多重PCR引物,其核苷酸序列为SEQ ID NO:4‑9;本发明整合3个乌苏里拟鲿雄性特异性标记,开发了用于性别检测的多重PCR引物及其检测方法,有效排除零等位基因的干扰,能够高效、准确地实现乌苏里拟鲿的性别检测,可用于各类乌苏里拟鲿群体的性别比例与性别结构的检测与分析;本发明还公开了用于上述乌苏里拟鲿性别检测的试剂盒;本发明检测效率高,鉴定结果准,对促进乌苏里拟鲿全雄育种进程具有重要意义。