本发明公开了一种草铵膦脱氢酶突变体及其应用,该草铵膦脱氢酶突变体由SEQ ID No.2所示氨基酸的第90位、第91位、第376位进行单突变或多突变获得;其中,第90位的赖氨酸突变为丝氨酸;第91位甘氨酸突变为丝氨酸或脯氨酸;第376位的丝氨酸突变为精氨酸。本发明利用定点饱和突变技术对SEQ ID No.1所示的草铵膦脱氢酶基因进行突变,发现第90位、第91位、第376位是影响酶活的关键位点,获得比酶活远高于母本草铵膦脱氢酶的突变体,其中,突变体lvPDH‑K90S‑G91P‑S376R的比酶活较母本草铵膦脱氢酶提升了8.4倍,具有工业应用前景。