本发明公开了双辅酶依赖型草铵膦脱氢酶突变体及其在催化合成L-草铵膦中的应用,该双辅酶依赖型草铵膦脱氢酶突变体,其特征在于,所述突变体由SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第91位、第111位、第240位和第261位进行多点突变后获得。本发明不仅改变了草铵膦脱氢酶突变体的辅酶依赖性,由原来NADPH依赖性改为NADH/NADPH双依赖性,而且也对草铵膦脱氢酶催化活性进行了改造,活力有了较大提升,并将突变体进一步组合,获得了高活力菌株,催化制备的L-草铵膦转化率高、收率高、产物易于分离提纯且显著缩短了反应进程。