本发明公开了一种重组棘白菌素B脱酰基酶突变体及在生物催化棘白菌素B合成棘白菌素B母核中的应用,所述脱酰基酶突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列第287位、527位进行单突变或双突变获得;本发明通过突变auebda基因序列,改变AuEBDA一级结构和酶的构象,提高AuEBDA的催化性能。本发明系统分析了G287Q和R527V取代对ECB脱酰酶活性的影响。本发明构建的双突变体AuEBDA-G287Q/R527V的酶活较亲本酶野生型AuEBDA酶活提高2.5倍,催化效率kcat/Km增加2.9倍。