本发明涉及一种NADH激酶突变体及其编码基因，以及其在多酶偶联法生物合成L‑草铵膦、D‑氨基酸和L‑氨基丁酸中的应用。所述突变体为SEQ ID No.1所示的NADH激酶经下列之一的突变所得：(1)第175位苏氨酸T突变为组氨酸H；(2)第175位苏氨酸T突变为组氨酸H、第252位精氨酸R突变为丙氨酸A；(3)第175位苏氨酸T突变为组氨酸H、第252位精氨酸R突变为丙氨酸A、第332位异亮氨酸I突变为赖氨酸K。本发明NADH激酶突变体具有更好的催化效率，以中间产物PPO为底物进行催化反应时，转化率远高于原始酶，L‑草铵膦产率也大幅提升，克服了化学法合成L‑PPT所具有的工艺步骤多、反应条件苛刻、手性原料昂贵等缺点，是一种高效、低成本且环境友好的生产方式。
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