本发明涉及一种耐高温葡萄糖异构酶、突变体及其在制备D‑果糖中的应用。所述葡萄糖异构酶氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述突变体由序列如SEQ ID NO：3所示的氨基酸经定点突变而来。本发明提供了一种未被鉴定的全新耐高温葡萄糖异构酶及其突变体，该突变体具有超级最适反应温度120℃，比原始酶GtAI提高了60℃，属于文献报道的最高水平，解决了现有酶无法在高温生产高果糖浆的技术难题。使用本突变酶生产高果糖浆转化率最高可达75.7％，高于原始酶和其他突变酶的转化效果，同时也是文献报道的最高水平，具有较好应用前景。
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