本发明属于报告基因载体领域,具体涉及一种昆虫细胞用双荧光素酶报告基因载体、构建方法、重组载体及应用。该昆虫细胞用双荧光素酶报告基因载体是对psiCHECK‑2载体改造得到;所述改造包括使用OpIE2启动子替换原有SV40启动子,以及在HSV‑TK promoter和Synthetic poly(A)之间插入合成的DNA片段;所述psiCHECK‑2载体的hRluc基因下游供插入感兴趣的昆虫靶基因;所述合成的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明提供的昆虫细胞用双荧光素酶报告基因载体,确保在昆虫细胞中强有力的基因转录和mRNA加工,适用于昆虫基因功能研究。