本发明公开了人博卡病毒HBoV1非结构蛋白NP1单链抗体制备及应用,所述单链抗体包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的轻链可变区。本发明以HBoV1的NP1蛋白为抗原制备了特异性的单克隆抗体,通过获取其重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列,构建了与NP1蛋白特异性结合的单链抗体;本发明的单链抗体不仅能用于NP1在病毒复制过程的功能研究,而且其通过结合NP1蛋白抑制病毒基因表达和转录的功能,也为抗博卡病毒药物的开发以及制备靶向NP1的嵌合型抗体及人源化抗体提供了重要参考,另外还可用于开发靶向该重要的保守的非结构蛋白的诊断试剂盒。