本发明公开了靶向新冠病毒N蛋白的鲨鱼单域抗体及其制备方法和应用,属于生物技术领域;氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示,核苷酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示;同时本发明还提供一种靶向新冠病毒N蛋白的鲨鱼单域抗体的制备方法,通过分离免疫条纹斑竹鲨外周血淋巴细胞,提取总RNA,再反转录为cDNA;以cDNA为模板,扩增条纹斑竹鲨vNAR片段,与载体连接构建噬菌体文库;从噬菌体文库中淘选识别新冠病毒N蛋白的阳性克隆;构建表达载体,诱导表达新冠病毒N蛋白单域抗体,最终获得靶向新冠病毒N蛋白的鲨鱼单域抗体。