本发明公开了一种功能序列和结构模拟相结合的基因挖掘方法、NADH偏好型草铵膦脱氢酶突变体及应用。所述基因挖掘方法包括：(1)分析NADH型谷氨酸脱氢酶应具备的特性序列；(2)根据特征序列搜索基因库；(3)对搜索获得的基因进行聚类分析和蛋白结构模拟；(4)选择基因聚合度高且蛋白结构与已知草铵膦脱氢酶结构类似的基因作为候选基因。经基因挖掘得到来源于堆肥赖氨酸杆菌(Lysinibacillus composti)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的野生型草铵膦脱氢酶，并经过突变筛选到NADH偏好型草铵膦脱氢酶突变体，突变位点选自以下一种：(1)A144G‑V375F‑M91A；(2)A144G‑V345A‑M91A；(3)A144G，该突变体酶能够利用廉价的辅酶NAD进行催化反应。
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