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本发明属于生物酶保存技术领域，具体涉及一种菠萝蛋白酶冻干保护剂及其制备方法。其组成包括下述组分：30～50份海藻糖、8～10份普鲁兰、3～10份麦芽糊精、12～22份甘露醇、1～4份山梨醇、4～12份甘氨酸、0.05～0.2份聚山梨酯‑20、1.5～4.5份缓冲剂、0.2～0.8份N‑乙酰半胱胺酸、0.05～0.3份氧化型谷胱甘肽、0.8～2.5份PEG和0.05～0.3份抗氧化剂。本发明以海藻糖‑普鲁兰多糖为主骨架，抑制冰晶生长并降低水活度；甘露醇构建晶相支撑网络，聚山梨酯‑20稳定界面；通过氧化型谷胱甘肽暂封巯基，微囊化N‑乙酰半胱胺酸实现复溶时可控还原；磷酸钠缓冲体系维持pH稳定。