本发明公开了一种基于多表位融合多肽的非洲猪瘟亚单位疫苗及其制备方法和应用,属于兽用生物制品技术领域。所述疫苗包含SEQ ID NO:1所示的融合多肽,其由ASFV关键蛋白CD2v、p54、p72、p30的保守表位与免疫增强分子(猪IFN‑α、DP238L)通过柔性连接肽串联形成,并联合ISA 201与CpG‑ODN双佐剂系统。通过优化表位排列顺序,显著提高蛋白表达量、稳定性及免疫原性。实验表明,该疫苗在猪体内可诱导高效抗体和强效细胞免疫。本发明的非洲猪瘟疫苗基于亚单位设计,安全性高,适用于工业化生产,为非洲猪瘟的亚单位疫苗研发提供了良好的参考和研究方向。