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本发明提供一种毛霉型豆豉苦味肽的制备方法及应用，制备粉末A、粉末B、粉末C；将粉末C溶于去离子水中，以A相质量分数0.05％三氟乙酸水溶液和B相质量分数0.05％三氟乙酸乙腈溶液为洗脱液，采用半制备型HPLC反相C18柱进行梯度洗脱，收集目标峰，冷冻干燥，得粉末D；将粉末D溶于去离子水中，以A相质量分数0.05％三氟乙酸水溶液和B相质量分数0.05％三氟乙酸乙腈溶液为洗脱液，采用分析型HPLC反相C18柱进行梯度洗脱，收集目标峰，冷冻干燥，得苦味肽I。制得的苦味肽I应用于食品中，提供食品豆豉苦味，增加食品的鲜味；该苦味肽易于化学合成，且合成的产品纯度高，稳定性好，可扩宽该苦味肽的应用领域。