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本发明涉及生物技术领域，具体涉及2‑甲基柠檬酸在抑制敲除2‑甲基柠檬酸脱水酶基因prpD的芽胞杆菌芽胞形成中的应用及在制备抑制敲除2‑甲基柠檬酸脱水酶基因prpD的芽胞杆菌芽胞形成的抑制剂中的应用，还提供了一种抑制敲除2‑甲基柠檬酸脱水酶基因prpD的芽胞杆菌芽胞形成的抑制剂，包括2‑甲基柠檬酸。本发明首次发现敲除了prpD的芽胞杆菌由于2‑甲基柠檬酸的积累可以抑制其芽胞的形成，抑制率达到100％。同时敲除prpD、prpC和prpD的芽胞杆菌，无法合成2‑甲基柠檬酸，外源添加2‑甲基柠檬酸，可以对芽胞杆菌的芽胞形成产生抑制作用，当2‑甲基柠檬酸的添加浓度达到200μg/mL时，其对芽胞的抑制率达到81％。