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本发明公开了一种界面自组装羰基还原酶及在(R)‑3‑羟基‑3‑苯基丙酸乙酯合成中的应用，将羰基还原酶加入Tirs‑HCl缓冲液中，再加入聚苯乙烯的甲苯溶液，在黑暗、40～100r/min、20～40℃条件下，于摇床中震荡反应1～4小时，离心，获得上层为有机相、中间层为界面自组装羰基还原酶、下层为水相的反应体系，取出中间层用甲苯和Tris‑HCl缓冲液洗涤，获得界面自组装羰基还原酶；本发明构建的界面自组装羰基还原酶在有机相和水两相界面具有较好的催化功能，能够将3‑羰基‑3‑苯基丙酸乙酯转化为(R)‑3‑羟基‑3‑苯基丙酸乙酯，(R)‑3‑羟基‑3‑苯基丙酸乙酯的对映体过剩值大于99％。

本发明涉及生物技术领域，公开了一种羰基还原酶突变体及其在酶法合成手性醇中的应用。本发明通过将如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列进行第36位赖氨酸突变为天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸中的任意一种或/和第125位组氨酸突变为赖氨酸、丝氨酸、亮氨酸中的任意一种，或和第170位组氨酸突变为赖氨酸、半胱氨酸、亮氨酸中的任意一种的突变，使得到相较于野生型的活性具有不同程度的提升的羰基还原酶突变体，尤其是单点突变体Mut‑T75K、Mut‑T75D、Mut‑E216M以及组合突变体Mut‑T75K‑E216M，具有优异的相对酶活、热稳定性及对底物的耐受性，且针对多种手性醇都具有较高的活性与稳定性，具有催化活性高、热稳定性高、底物耐受性强、易于发酵等优点。

本发明提供了一种利用固定化大肠杆菌(E.coli)工程菌细胞催化合成他汀类药物手性中间体(3R,5S)‑6‑氯‑3,5‑二羟基己酸叔丁酯与(3R,5R)‑6‑氰基‑3,5‑二羟基己酸叔丁酯的方法。包括含羰基还原酶大肠杆菌工程菌的培养、固定化细胞的制备、固定化细胞催化新型药物手性中间体(3R,5S)‑6‑氯‑3,5‑二羟基己酸叔丁酯与(3R,5R)‑6‑氰基‑3,5‑二羟基己酸叔丁的合成。本发明方法采用固定化生物大肠杆菌工程菌细胞为催化剂，稳定性好，使用寿命长，有机溶剂耐受性好，可多次重复利用，并且无需昂贵的外源辅酶添加，可在有机相反应体系中催化他汀药物中间体的合成，产品产率与纯度高，并可大幅度降低生产成本，简化工艺步骤，减少“三废”排放，在他汀类药物手性中间体的工业化生产中具有极高应用价值。

本发明公开了一种羰基还原酶BsCR突变体、工程菌及合成克唑替尼手性中间体的应用，本发明羰基还原酶BsCR突变体的活性和稳定性明显提高。本发明所获得的突变体比酶活与野生型BsCR相比显著提高，其中BsCRM2突变体在45℃半衰期为52.1h，相比于母本WT‑BsCR提升了2.9h，比活性与野生型BsCR相比提高了87.7倍，最高底物投料量可达到100g/L 2,6‑二氯‑3‑氟苯乙酮(CFA)，产物浓度随反应时间的延长而逐渐增加，6h内绝大部分底物可被转化(底物转化率为92.06％)，产物e.e.值始终保持在99.5％以上，时空产率为368.24g/L/d。

本发明公开了一种改造羰基还原酶立体选择性的方法、羰基还原酶突变体及应用，通过酶结合口袋的大小和形状鉴定羰基还原酶立体选择性，反Prelog酶的口袋外部形状接近于立方体，Prelog酶的口袋外部形状更类似于长方体，通过调控关键位点氨基酸可实现酶立体选择性的反转或提升。本发明制备的羰基还原酶突变体KmCR‑E87D/A129C/V239N的立体选择性(99.5％deP,R)较野生型KmCR(99.5％deP,S)得到反转，在10h能不对称合成35.4mM的6‑氰基‑(3R,5R)‑二羟基己酸叔丁酯。