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本发明提供敲除T6SS‑1基因簇的杀香鱼假单胞菌鱼用减毒疫苗，属于动物疫苗技术领域，包含杀香鱼假单胞菌基因组其中一套VI型分泌系统基因簇的敲除株，其构建方法为：采用重叠PCR途径获得T6SS‑1基因簇上下游序列的拼接片段；将拼接片段连接到pK18mobSacB上构建成敲除载体及将敲除载体化转至感受态大肠埃希菌中，并通过接合的方式将敲除载体转移至杀香鱼假单胞菌细胞中，进行两次同源重组交换实现靶基因的敲除。本发明将T6SS‑1基因簇敲除而实现减毒的杀香鱼假单胞菌减毒疫苗，其相对于野生株毒力显著减弱，同时保留良好的免疫原性，对接种鱼类宿主具有良好的免疫保护作用，并且敲除株的毒力不发生回复。