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本发明公开了一种提高枯草芽孢杆菌重组蛋白胞外生产水平的信号肽突变体及应用，属于基因工程技术领域。本发明通过对信号肽M1(MSDEQKKPE QIHRRDILKWGAMAGAAVA)的N端区域进行定向进化，筛选获得具有高效胞外分泌水平的信号肽突变体文库，通过该突变体文库构建获得系列重组蛋白胞外分泌水平显著提高的重组枯草芽孢杆菌菌株。将获得的正向信号肽突变体进行排列组合复合突变，获得具有高效重组蛋白表达分泌水平的信号肽复合突变体，利用其构建获得具有高效胞外蛋白胞外分泌水平的枯草杆菌杆菌突变株。本发明所筛选获得的信号肽突变体，对于重组蛋白在枯草芽孢杆菌中具有高效的胞外蛋白分泌水平，重组蛋白胞外分泌水平提高了15倍以上。本发明方法对信号肽改造及重组蛋白在宿主中的高效分泌与生产具有重要指导意义。