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本发明公开了一种高灵敏度真菌检测试剂盒及检测方法，包括A试剂和B试剂；所述A试剂为连接有适配体的纳米铜修饰磁性微球，所述B试剂为负载型纳米银复合材料，其能够与A试剂结合。该试剂盒检测时，先利用A试剂与待测样品混合，实现目标真菌的捕获与富集，所得富集样品再与所述B试剂混合孵育得到检测样品，最后对检测样品进行拉曼检测，根据目标真菌对应的拉曼特征峰的分析实现待测样品中目标真菌的定性和/或定量检测。本发明借助拉曼增强效应，能够实现真菌(如口腔念珠菌)的高灵敏度、快速检测，操作简单，检测耗时短，且具有较好的通用性，只需根据检测对象采用不同的适配体即可，具有很好的推广应用前景。