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本发明提供了一种基于润湿性调控的微纳自组装结构制备方法，包括如下步骤：通过激光填充刻蚀在基底表面的微纳自组装结构图形内部制备出具有微纳粗糙结构的微纳自组装结构图形；将基底表面用N‑异丙基丙烯酰胺薄膜改性；将第一步中未填充扫描过的区域，采用脉冲激光束扫描抛光工艺，进行填充抛光，使得被扫描区域的N‑异丙基丙烯酰胺薄膜被烧蚀而完全去除且其表面粗糙度小于激光填充刻蚀所获得的微纳粗糙结构的表面粗糙度，从而制备出一种自定义图形化的微纳自组装结构。相比传统基于IC工艺的微纳自组装结构制备工艺，本发明所述的方法具有步骤简单、工艺成本低、效率高的优点，尤其适合于单件/小批量、自定义的微纳自组装结构样品制备。