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本发明提供了一种细胞凋亡检测试剂盒及其检测方法，其中，细胞凋亡检测试剂盒包括以下体积原料：2‑3μL膜联蛋白V、0.5‑1.5mL结合液、0.5‑1.5mL封闭液、2‑3μL活性染料Ⅰ、4‑6μL活性染料Ⅱ，所述结合液由质量体积比g/mL为(0.6‑1.0):(0.05‑0.1):(0.8‑1.2):(96‑98)的甾体皂甙、钙离子溶液、4‑羟乙基哌嗪乙磺酸、水组成，所述封闭液由质量体积比g/mL为(0.6‑0.8):(6‑8):(6‑10)的鱼精蛋白、氯化钠溶液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液组成。本发明制得的细胞凋亡检测试剂盒及其检测方法可以减少活性染料的荧光淬灭、提高膜联蛋白V和磷脂酰丝氨酸的结合能力，进而提高检测出的细胞凋亡率、细胞坏死率，提高检测结果的准确性。