在大于10kb环状DNA分子上实现定点突变的方法

摘     要：本发明涉及一种在大于10kb环状DNA分子上实现定点突变的方法：a)设计带突变位点的引物A和与之紧邻的反向引物B；b)多聚核苷酸激酶分别磷酸化A和B的5'末端；c)选用无5'‑3'外切核酸酶活性且扩增产物3'端不带有“A”碱基的DNA聚合酶进行PCR扩增，将所得目的片段通过琼脂糖凝胶进行回收；d)DNA连接酶环化回收产物并转入感受态细胞，筛选突变质粒。本发明的优点在于，通过对引物5'末端进行磷酸化，提高线型突变体自身环化的效率；通过选择特殊DNA聚合酶，保证了扩增片段上突变位点的稳定性。本方法可实现在大于10kb的环状DNA大分子上稳定、高效地定点突变，并且能同时适用于甲基化和非甲基化的DNA模板，在11kb左右的质粒上单点突变阳性率高达87%以上。

著 录 项： 

• 1． 买家选定所需专利，确认国家手续办理方，下单，确认交易合同；
  2． 卖家确认专利可交易；
  3． 买家支付交易款项到平台；
  4． 买卖双方签订《专利转让委托书》、《转让协议》、《解除代理委托书》各一式两份并提交给办理国家手续方；
  5． 办理国家手续方提交办理官方手续，国家知识产权局1个月左右下发《著录项目变更手续合格通知书》；
  6． 买家确认收到《专利证书》、《著录项目变更手续合格通知书》；
  7． 平台把交易款项支付给卖家，至此专利转让合同完成。
  

• 交易方	企业	个人
  买家	营业执照副本复印件（需盖公章）	身份证复印件（签字）
  	专利转让委托书（需盖公章）一式两份	专利转让委托书（需签字）一式两份
  	专利转让协议（需盖公章）一式两份	专利转让协议（需签字）一式两份
  卖家	营业执照副本复印件（需盖公章）	身份证复印件（需申请人签字）
  	解除代理委托书（需盖公章）一式两份（如专利通过代理机构申请）	解除代理委托书（需签字）一式两份（如专利通过代理机构申请）
  	专利转让协议（需盖公章）一式两份	专利转让协议（需签字）一式两份
  	专利请求书或手续合格通知书、授权通知书复印件	专利请求书或手续合格通知书、专利授权通知书复印件
  	专利证原件（若授权下证）	专利证原件（若授权下证）

• 日期	法律信息	备注
  2020/08/07	授权
  2018/05/11	实质审查的生效	IPC(主分类): C12N 15/10 专利申请号: 201711203895.9 申请日: 2017.11.27
  2018/04/03	公开