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本发明公开了一种使用两步酶催化法制备富含游离脂肪酸油脂组合物的方法及应用，脂肪酸的生物合成及酶催化技术领域，本发明采用使用的油脂为DHA和EPA的总含量≤8％的油脂，甘油、脂肪酶于反应器中，在40～70℃温度条件下，反应体系压力0～500Pa条件下进行甘油解反应，反应3～20h后，回收脂肪酶，获得油脂混合物；取上述得到的油脂混合物，加入水溶液、脂肪酶，在pH＝5～8，反应温度为30～60℃的环境下进行水解反应，反应0.5～20h后，回收脂肪酶和水溶液，获得富含游离脂肪酸的油脂组合物，水解率可以达到80％以上，水解反应结束之后，脂肪酶水相可同时回收重复利用，既降低生产成本，又减少废水的排放。