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本发明公开了基于两性离子单体的L‑苯丙氨酸印迹水凝胶的制备方法，具体包括以下步骤：将1‑乙烯基咪唑与1,3‑丙烷磺酸内酯进行烷基化反应，制备两性离子单体VSPIM；以L‑苯丙氨酸作为模板分子，以制备的VSPIM作为功能单体，以N,N‑亚甲基双丙烯酰胺作为交联剂，以水作为溶剂，通过氧化还原反应引发聚合，得水凝胶；将所得的水凝胶在NaCl溶液中洗涤，并用紫外分光光度计测量洗脱液在259nm处的特征峰，洗涤过程一直持续到洗脱液的紫外光谱中无法观察到259nm处的特征峰为止，然后用去离子水，洗脱水凝胶表面的NaCl，即得印迹水凝胶。本发明利用两性离子基团来降低印迹水凝胶对蛋白质的非特异性吸附作用。