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本发明公开了一种A‑π‑D‑π‑A'型双光子荧光化合物及其合成方法和应用。所述化合物如式(Ⅰ)所示。本发明提供了一种所述化合物的合成方法，包括如下步骤：(1)式(Ⅱ)化合物与多聚甲醛和氢溴酸发生溴甲基化反应得到式(Ⅲ)化合物；(2)式(Ⅲ)化合物先与六亚甲基四胺成盐，再发生水解反应得到式(Ⅳ)化合物；(3)式(Ⅳ)化合物与2‑甲基苯并噁唑发生单边脱水缩合反应得到式(Ⅴ)化合物；(4)式(Ⅴ)化合物与式(Ⅵ)化合物发生脱水缩合反应得到式(Ⅰ)化合物。该化合物兼具大的双光子荧光活性吸收截面和斯托克斯位移、良好的活细胞穿透性和低细胞毒性，其能应用于活细胞中双光子荧光成像。