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本发明公开了一种基质金属蛋白酶-2特异性多模态分子影像探针的制备方法和应用。本发明的制备方法包括以下步骤：1）基质金属蛋白酶-2（MMP-2）特异性识别多肽底物的制备；2）在多肽底物上修饰近红外荧光染料；3）在多肽底物上修饰荧光淬灭基团；4）在修饰了近红外荧光染料和荧光淬灭基团的多肽底物上连接不同分子量PEG或者肿瘤靶向基团RGD；5）在上面修饰好的多肽底物侧链酪氨酸上标记核素。本发明与现有技术相比具有如下优点：1）利用探针对MMP-2蛋白酶的特异性和响应性，使探针在肿瘤部位选择性富集，以提高探针对肿瘤的靶向性；2）通过使用光学、光声和SPECT等先进的分子成像技术开展活体内肿瘤的多模态成像，提高肿瘤成像的灵敏度和准确性，最终实现对肿瘤的精准定位；3）为肿瘤的早期诊断、发病进程研究及预后评估提供新的思路和方法。