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本发明公开了一种3D纸基微流控骨保护素检测装置、制备方法及应用，涉及纸基微流控领域。所述装置包括：纸基导流层、纸基检测层及吸收层；所述纸基导流层上基于蜡印加热法形成有周边疏水的亲水图案区；亲水图案区用于接收混合流体；混合流体包括待检测样品和抗体‑显色溶液；纸基检测层上基于蜡印加热法形成有标准指示区，以及与亲水图案区相对应的用于接收经亲水图案区渗透的混合流体的检测区；检测区固定有人骨保护素抗体，标准指示区染有用于指示人骨保护素浓度梯度的标准浓度检测显色；吸收层用于收集检测后余下的经纸基检测层渗透的废液。相较于现有技术，本发明可实现对人骨保护素样品的即时检测，生产成本低，便携性强，无大型仪器依赖性，应用场景广泛。