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本发明公开了过氧麦角甾醇体外培养NK细胞提高其杀伤力的用途。本发明发现，过氧麦角甾醇孵育可以有效提高NK细胞对肿瘤细胞的杀伤力，且该杀伤力随着过氧麦角甾醇孵育浓度的提高而增强。因此，可以将过氧麦角甾醇用于NK细胞体外培养，获得杀伤力更强的NK细胞，为过继性NK细胞治疗创造更好的疗效。

本发明涉及一种融合蛋白及其在增强自然杀伤(NK)细胞免疫功能中的应用。该融合蛋白包括CD16a信号肽、IL‑15Rα功能区、柔性连接肽、IL‑15活性核心序列以及高亲和力突变型CD16a跨膜结构域，能够有效定位于细胞膜并保持IL‑15的功能活性。通过慢病毒载体将其导入NK细胞中，所获得的基因工程NK细胞在低氧环境下稳定表达该融合蛋白，显著提升细胞增殖能力、ADCC功能和肿瘤杀伤活性。体外实验表明该工程NK细胞在乳腺癌PDX模型中表现出优异的杀伤效果，尤其在联合双特异抗体作用下杀伤率高达97.1％。该发明为细胞免疫治疗提供了新型且有效的分子工具。

本发明公开了一种多功能免疫调节融合蛋白、其制备方法、表达该蛋白的NK细胞及应用。该融合蛋白结构为抗CD16a VHH‑(GGGGS)3‑抗NKG2D VHH‑(EAAAK)2‑IL‑15Rβ超级激动肽，氨基酸序列为SEQ ID NO:1。其中抗CD16a VHH和抗NKG2D VHH协同激活免疫效应细胞，IL‑15Rβ超级激动肽强效激活效应细胞且弱激活Treg，连接子确保各结构域功能独立。该蛋白可高效制备，产率155mg/L且纯度超95％，能显著激活NK细胞和CD8+T细胞，体外对多种肿瘤细胞24h裂解率达87.0％‑90.0％，体内显著抑制肿瘤生长，抑制率81.3％，延长荷瘤小鼠生存期超60天。表达该蛋白的NK细胞经MI‑3处理后稳定性提升，为肿瘤免疫治疗提供高效安全候选药物。

本发明公开了一种HER2单域抗体‑pH响应型靶向多肽融合结构及其在CART治疗中的应用。该融合结构结合了pH敏感靶向基序与高亲和力HER2单域抗体，在中性pH下维持隐蔽状态，降低非特异性结合，而在肿瘤微环境(pH<6.8)中发生构象变化，暴露HER2靶向基序，从而显著提高CART细胞的HER2阳性肿瘤识别和杀伤能力，减少脱靶毒性，提高疗效。因此，本发明结合pH响应型靶向多肽与HER2单域抗体，提高了CART细胞的HER2阳性肿瘤靶向性和抗肿瘤活性，降低了脱靶毒性；该策略可广泛应用于HER2阳性乳腺癌、胃癌、卵巢癌等实体瘤的CART治疗，具有显著的临床转化潜力。