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本发明提供了一种脱细胞外基质及其制备方法和应用，属于生物医学工程技术领域。本发明将软组织置于第一有机溶剂中进行浸泡处理，得到浸泡软组织；将所述浸泡软组织与第二有机溶剂混合，在超临界二氧化碳存在条件下进行脱细胞处理，得到脱细胞外基质。本发明首先将软组织置于第一有机溶剂中进行浸泡处理，可以对软组织进行脱水以及脱脂处理，另外软组织经过浸泡处理后能够更好的使超临界二氧化碳进入软组织，有利于提高超临界处理效果；本发明基于超临界二氧化碳流体技术进行脱细胞处理，处理过程中有机溶剂会被二氧化碳带走，几乎无有机溶剂残留，处理效率高对脱细胞外基质内活性物质损伤较小，且能够获得整张大块膜状脱细胞外基质。