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本发明涉及纳米材料领域，为解决现有复合微球信号强度有限、功能单一、制备过程繁琐等问题，提供了一种基于多层级组装结构的荧光/比色双功能微球及其制备方法。其通过树状介孔硅球和致密二氧化硅壳层构建多层级结构，并在不同层级表面分别负载油溶性的金纳米颗粒和量子点。首先在有机相中制备树状介孔硅球/金纳米颗粒组装体，通过有机硅烷水解缩合、Stöber生长制备树状介孔硅球/金纳米颗粒/二氧化硅微球，然后对其进一步修饰巯基并与油相量子点组装，经过相转移并包覆二氧化硅得到生物相容性好、光学/胶体稳定的荧光/比色双功能微球。该微球可作为双信号标记探针，应用于侧流免疫层析平台，有望实现可视化及超灵敏定量检测并提高检测准确度。