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本发明涉及分子标记鉴定领域，具体公开一种利用特定引物组鉴别两种梅童鱼幼鱼的方法，两种梅童鱼幼鱼分别为黑鳃梅童鱼幼鱼和棘头梅童鱼幼鱼，特定引物组由正向引物L14734：AACCACCGTTGTTATTCAACT，反向引物Cytb：CTCAGAATGACATTTGTCCTCA、Cytb‑R：GTTGCGGCCGCGACAATAAAG组成。利用特定引物组PCR扩增黑鳃梅童鱼与棘头梅童鱼的基因组DNA并电泳检测，电泳谱图显示：黑鳃梅童鱼的PCR扩增产物仅在近500 bp处出现一条特异亮带，棘头梅童鱼的PCR扩增产物在近360 bp和近500 bp处各出现一条特异亮带，从而准确、快捷的区分两种幼鱼。